יום הכיפורים, החל ביום העשירי בחודש תשרי, הוא החג המקשר בין ראש השנה וסוכות (המרכזי שבחגי תשרי), ולכן יש הרואים בו הכנה לחג סוכות: טיהור המקדש והעם לקראת חג הסוכות, בדומה לטקסי הכפרה שהיו נפוצים במזרח הקדמון. גם בספרות האכדית רווחים טקסי פיוס האלים על ידי טיהורו של הרע והרחקתו, בבחינת "כי ביום הזה יכפר עליכם לטהר אתכם מכל חטאותיכם…" כנאמר בספר ויקרא (טז, ל).
יום מיוחד זה, שבו היה הכוהן הגדול נכנס לקודש הקודשים בבגדי בד, מעלה קורבן עולה ומתוודה, שעה שכל העם מתענה ונמנע מאכילה ומשתייה, מרחיצת הנאה, מסיכת גוף בשמן, מנעילת סנדלי עור ומיחסי אישות, מייצג "מעין מוות" או ויתור סמלי על הקיום הפיזי, כדי להבטיח תחייה מחודשת. יום הכיפורים, במובן הזה, הוא גם עצירת הזמן לאחור, לשנה הקודמת. עם תקיעת השופר במוצאי יום הכיפורים מתחילה העונה החדשה והחברה מתירה לעצמה את השמחה ואת ההוללות האופייניות לחג הסוכות.
יום הכיפורים נזכר ברשומות היהודיות העתיקות כמועד מכלל מועדי ישראל, ולכן ניתן לשער שהוא לא היה יום צום ואבל בלבד, אלא גם יום טוב, כמסופר במשנה, מסכת תענית: "לא היו ימים טובים לישראל כחמישה עשר באב וכיום הכיפורים, שבהן בנות ישראל יוצאות בכלי לבן שאולין, כדי שלא לבייש את מי שאין לו, ובנות ירושלים יוצאות וחולות (מחוללות) בכרמים".
האם ריקודי הבתולות היו ריקודים פולחניים שנערכו בימי הצום ועינוי הנפש? ייתכן שבימי קדם היה יום הכיפורים יום של שמחה על טיהור המקדש, על טיהור אישי מן החטאים ואולי גם בשל התחושה שניתן לשלוט בגורל ולהשפיע על חתימת הדין.
על פי המקורות המקראיים, עיקרו של יום הכיפורים במקרא הוא "עינוי נפש", כתנאי לכפרת עוונות, ואיסור כל מלאכה. מספר ישעיהו אנחנו למדים כי עינוי הנפש התפרש כצום. עיקרו של ריטואל יום הכיפורים מתואר בספר ויקרא, כעבודת הכוהן הגדול במקדש. חטאי היחיד כופרו אפוא על ידי הצום וכן, במושגי חז"ל, על ידי תשובה, תפילה וצדקה, ואילו חטאי הציבור טוהרו על ידי הכוהן הגדול. הריטואל כלל גם שילוח שעיר העזים ולעזאזל, כנראה למדבר שומם. חוקרים שונים רואים בכך שריד של השפעות פגאניות, ואילו חלק מהפרשנים המסורתיים גורסים שזהו מעין קורבן הניתן לשטן כדי שלא ירע לישראל.
הלכות יום הכיפורים מפורטות במשנה (מסכת יומא) וכוללות מנהגים שנוספו בימי הבית השני: ליל שימורים לכוהן הגדול ולנכבדי ירושלים, כהכנה לתפקידו החשוב ביום הכיפורים, ותפילה ומסיבה שערך הכוהן הגדול לאחר צאתו מבית קודש הקודשים ללא פגע.
לאחר חורבן הבית השני עבר מרכז החג מבית המקדש לבית הכנסת, ובמקום הקורבנות באה התפילה. המרכזית שבתפילות היא ה"וידוי", שקודם לכן נאמר מפי הכוהן הגדול ולאחר החורבן הועבר לכל פרט. תפילת ה"וידוי" ("על חטא שחטאנו לפניך") נאמרת עשר פעמים במהלך יום הכיפורים ויש בה רשימה של 44 חטאים, לפי סדר הא"ב, שני חטאים בכל אות. בווידוי כרוכה תמיד החרטה, המסייעת לאדם החפץ בתשובה, ואולם, לפי גרסת המשנה במסכת יומא: "האומר: אחטא, ויום הכיפורים מכפר, אין יום הכיפורים מכפר. עבירות שבין אדם למקום יום הכיפורים מכפר, עבירות שבין אדם לחברו אין יום הכיפורים מכפר, עד שירצה את חברו".
במהלך יום הכיפורים קוראים בבית הכנסת, בהפטרה של תפילת שחרית, את פרק נ"ח בישעיהו, שיש בו מחאה עזת ביטוי כנגד הסבורים כי הצום יכול לחפות על מעשי עוולה מוסריים. יש גורסים כי מתקפה זו על מרכזיותו של הצום בעיצומו של יום הצום הגדול, ביטאה לא רק את עמדת התנאים, שתבעו להדגיש את עדיפות ההתנהגות המוסרית על ההתנהגות הריטואלית, אלא גם מגמות אנטי-כוהניות. בהפטרה של תפילת מנחה קוראים את כל ספר יונה, שיש בו הרהור עמוק על דרכי האל בעולמו וגם קישור רלוונטי אל הצום, התפילה והתשובה.
שתי תפילות הנאמרות ביום הכיפורים נודעות בקרב כלל היהודים: "כל נדרי" ו"נעילה". "כל נדרי" נאמרת בליל יום הכיפורים, לפני תפילת ערבית, ותוכנה, ביטול נדרים שאדם נדר או ינדור. מקורה של התפילה אינו ידוע אך עדויות ראשונות על קיומה נמצאות בתקופת הגאונים, שרבים מהם, ובראשם עמרם גאון, ראש ישיבת סורא, התנגדו לה בחריפות ("מנהג שטות היא"). במאה ה-12 הוכנסו בה שינויים. את הביטוי "העבריינים" ("על דעת המקום ועל דעת הקהל אנו מתירים להתפלל עם העבריינים") הכניס לתפילה במאה ה-13 המהר"ם מרוטנבורג, אך התודעה העממית קושרת אותו בתופעת אנוסי ספרד ופורטוגל במאות ה-15 וה-16. בפולמוסים היהודיים-הנוצריים בימי הביניים הוטל אישום ביהודים שלנדריהם ולשבועותיהם אין ערך בשל הצהרת "כל נדרי", והם השיבו כי "כל נדרי" בא לבטל רק נדרים שנדר אדם על עצמו, ולא נדרים שבין אדם לחברו.
אף שמבחינת תוכנה וניסוחה אין לתפילת "כל נדרי" יתרון ערך כלשהו על תפילות אחרות, היא זכתה למעמד מיוחד בתודעת העם, ככל הנראה משום שהיא מעין הכרזת פתיחה ליום "הנורא והקדוש". אין ספק שגם הניגון המיוחד שבו נאמרת התפילה העצים את מעמדה.
הכינוי "נעילה" הוא קיצור הביטוי "נעילת שערים". תפילה זו נאמרת עם סיומו של היום, סמוך לשקיעת החמה. תחילה כונתה כך כי נאמרה שעה שנעלו את שערי בית המקדש, אך לאחר החורבן כוונה לנעילת שערי השמים בעת חתימת גזר הדין.
ליום הכיפורים אופייניים גם מנהגים עממיים לרוב המעידים, בין השאר, על מידת חשיבותו בחברה העממית היהודית. משהיה, בשלהי בית שני, ליום הקדוש ביותר בישראל, זכו גם מנהגים הנראים לנו היום כזרים, אליליים, "דרכי האמורי", ל"הכשר".
בין המנהגים האלה:
כפרות – מסובבים תרנגול מסביב לראש, זכר לגבר ונקבה לאישה, ואומרים: "זה חליפתי, זה כפרתי, זה התרנגול ילך למיתה ואני אכנס ואלך לחיים טובים ארוכים ולשלום". מנהג התרנגול לכפרות רווח בין עמים שונים ומקורו באמונה העממית כי ניתן להעביר מחלה, סבל או חטא מגוף אל גוף. זהו, אולי, התחליף ל"שעיר לעזאזל", אשר שולח על ידי הכוהן הגדול למדבר כשהוא נושא על גבו את חטאי העם. לתרנגול, על פי אמונות קדומות, כוחות מאגיים, כי קריאתו מגרשת את החשכה, מניסה את המזיקים ומביאה את האור. גם לכרבולתו האדומה ייחסו כוחות מאגיים, ולכן ה"כפרות" הן מעין קורבן למזיקים, להטלת פחד עליהם ולפיוסם. מנהג זה היה מראשיתו שנוי במחלוקת: הרשב"א והרמב"ן יצאו נגדו (הרמב"ם לא הזכירו כלל) ור' יוסף קארו (בעל שולחן ערוך) הגדירו "מנהג שטות" ופסק פסיקה חד-משמעית שאין לקיימו. למרות זאת, בעיקר בגלל השפעה קבלית ותמיכה עממית, התקבל המנהג, אם כי גם כיום שומרי מצוות רבים, ובכללם רבנים, אינם מקיימים טקס זה.
מלקות – בקהילות שונות היה נהוג, לאחר תפילת מנחה, להלקות. השמש היה מלקה ברצועה גדולה את בעלי הבתים המבוססים, שהיו כורעים על ערמת שחת בבית הכנסת, ארבעים מלקות חסר אחת. העניים לא זכו במלקות משום שלא עלה בידם לשלם לשמש.
נר החיים – ההשערה הרווחת היא שבימי הביניים נהגו יהודים בארצות אירופה המערבית לבוא לבית הכנסת ונר בידם, לכבוד בני המשפחה, המייחלים ביום הכיפור כי יידונו לחיים ארוכים וטובים. במשך הזמן החלו בני המשפחה להביא נרות כמספר הזכרים במשפחה. מנהג זה הלך והתפשט בקהילות נוספות, קרובות ורחוקות.
נר נשמה – באחד ממדרשי התנאים הועלה הרעיון שגם המתים צריכים כפרה. נראה שעל יסוד מדרש זה הנהיגו בימי הביניים הדלקת "נר נשמה" בבית הכנסת לכפרת נשמותיהם של הורי המדליקים שנפטרו, לצד "נר החיים". הנרות הוכנו בידי הנשים והתקשרו למנהג "הנחת הפתילות" שרווח במזרח אירופה: הנשים מדדו בחוטים את קברות אבותיהן וקרובי משפחה נוספים, קיפלו את חוטי המדידה ומהם הכינו פתילות לנרות שעווה לזכר הנשמות. בשעת הנחת הפתילות קראו תחינות מיוחדות והתפללו למתים על החיים.
הצבע הלבן – בעדות שונות נהוג ללבוש בגדי לבן, שהם גם סמל לזיכוך והיטהרות וגם אזכור לתכריכים, ליום המוות. במספר עדות (בבל, תורכיה, יוון) נהגו לשתות משקה לבן שמשמעותו דומה.